1) Bezpečnost práce, GMO, vybavení laboratoře molekulární biologie, přístroje, materiál, pipetování malých objemů. Izolace genomové DNA z listu podle Edwardse a kol. (1991). Homogenizace tekutým dusíkem. 2) Stanovení koncentrace a kvality izolované DNA. Spektrometricky, Nanodrop, elektroforeticky. Příprava agarózového gelu, nanášení vzorků, včetně kontrol, vyhodnocení. 3) Transformace chemicko-kompetentních buněk E. coli, DH5?, expresním vektorem. Příprava kultivačního média, kultivace, E. coli/vektor, vyhodnocení transformace. 4) Izolace plazmidové DNA (Mini-prep, kolonky). Stanovení koncentrace a kvality izolované pDNA. Kontrola izolované pDNA na gelu, specifikace fragmentů pDNA. Srovnání s genomickou DNA. 5) Transformace rostlin ječmene, tabáku, apod. pomocí Agrobacterium tumefaciens a pomocí biolistiky. 6) PCR, princip, návrh primerů pomocí programu Primer3 pro detekci zájmového genu v izolované DNA (Cvičení 1). 7) Příprava PCR reakční směsi včetně kontrol. Nastavení podmínek reakce na termocycleru. Příprava agarózového gelu, nanesení vzorků. Vyhodnocení pomocí dokumentačního zařízení, stanovení přítomnosti zájmového genu v izolované genomové DNA. 8) Kolokvium, závěrečný test.
|
-
Alberts, B. et al. (2014). Molecular Biology of the Cell. Garland Science.
-
Brown, T.A. (2016). Gene Cloning and DNA Analysis. WILEY Blackwell.
-
Clark, D. Pazdernik, N. (2015). Biotechnology, 2nd Edition. Academic Cell.
-
Glick B.R., Pasternak J.J., Patten Ch. (2010). Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, 4th Edition. ASM Press, USA, 2010. ISBN 978-1-55581-498-4.. Washington DC.
-
Šmarda, J. a kol. (2005). Metody molekulární biologie. Nakladatelství MU Brno.
|