|
Vyučující
|
-
Sojka Jiří, Mgr. Ph.D.
-
Šamajová Olga, Mgr. Dr.
-
Luptovčiak Ivan, Mgr. Ph.D.
-
Polláková Kateřina, Mgr.
-
Buzáš Marek, Mgr.
|
|
Obsah předmětu
|
Semináře: 1) Vymezení základních pojmů, historie transformací a transgenoze rostlin, bakterie Agrobacterium tumefaciens - Ti-plazmid Rozdělení vědeckých článků studentům na Journal cluby. 2) Princip transformace pomocí A. tumefaciens: geny virulence, přenos T-DNA do rostlin. Jiné druhy rodu Agrobacterium 3) Stabilní vs tranzientní transformace rostlin: transgenoze jedno- a dvouděložných rostlin; metody tranzientní transformace listů, děloh, protoplastů. Metody stabilní transformace rostlin 4) Složky transgenů - promotory, terminátory, polyadenylační signál, 5´nekódující region 5) Umlčování genů - T-DNA inzerční mutageneze, RNAi techniky 6) Reportérové geny a markerové linie. Selekční markery pro rostlinné transgeny - antibiotika, herbicidy, zdroj sacharidů, rostlinné hormony. 7) Ztráty aktivity transgenů - transkripční a posttranskripční inaktivace transgenu, mutace Journal club I 8) GMO - tolerance k herbicidům a k hmyzím škůdcům, inhibitory proteáz. Journal club II 9) GMO - jiné transgeny využívané v dnešní době. GMO v polních pokusech. Journal club III 10) GMO - polní pokusnictví Journal club IV 11) GMO a legislativa v ČR. GMO vs Eko-Bio trvale udržitelné zemědělství, závěrečná diskuze 12) Zápočtový test CVIČENÍ: 1) Metody pěstování Arabidopsis thaliana. Prakticky: výsev Arabidopsis thaliana, ekotyp Columbia pro stabilní transformaci metodou floral-dip. 2) Pěstování bakterií E. coli a A. tumefaciens, složení médií. Prakticky: příprava médií pro pěstování A. tumefaciens, očkování A. tumefaciens do tekutého média a na pevné médium. 3) Tranzientní transformace - přehled metod Prakticky: tranzientní transformace listů N. bentamiana pomocí A. tumefaciens 4) Prakticky: mikroskopické sledování transformovaných listů N. benthamiana 5) Prakticky: tranzientní transformace semenáčků A. thaliana pomocí A. tumefaciens 6) Prakticky: Mikroskopické sledování transformovaných semenáčků A. thaliana 7) Metody izolace bakteriální DNA Prakticky: izolace bakteriální DNA. 8) Stabilní "FloralDip" transformace rostlin A. thaliana. Prakticky: stabilní "FloralDip" transformace rostlin A. thaliana vysetých v prvním cvičení 9) Prakticky: práce s transformovanými semeny A. thaliana: AraSYSTEM. 10) Selekční markery pro rostlinné transgeny Prakticky: Příprava selekčních médií pro výsev semen A. thaliana. Sterilní výsev transformovaných semen. 11) Prakticky: Selekce transformovaných rostlin 12) Závěrečná konzultace a prezentace protokolů z praktických cvičení.
|
|
Studijní aktivity a metody výuky
|
Monologická (výklad, přednáška, instruktáž), Dialogická (diskuze, rozhovor, brainstorming), Pozorování, Demonstrace, Nácvik pohybových a pracovních dovedností, Laborování
- Účast na výuce
- 40 hodin za semestr
- Semestrální práce
- 10 hodin za semestr
- Příprava na zápočet
- 20 hodin za semestr
|
|
Výstupy z učení
|
Cílem předmětu je seznámit studenty se základními principy genetické transformace rostlin a s možnostmi využití transgenních technologií v základním i aplikovaném výzkumu. Studenti získají teoretické znalosti o metodách přenosu genetické informace do rostlinných buněk, principech tvorby transgenních rostlin a jejich využití při studiu genových funkcí i při cílené modifikaci vlastností hospodářsky významných plodin. V úvodní části semináře jsou probírány základy rostlinné transgenóze, včetně principů tranzientní a stabilní genetické transformace. Pozornost je věnována zejména transformaci rostlinných buněk zprostředkované bakterií Agrobacterium tumefaciens a přímým metodám přenosu DNA do rostlinných buněk. Další část semináře je zaměřena na využití genetické transformace v základním výzkumu. Studenti se seznámí s metodami cílené změny genové exprese a funkční analýzy genů, včetně T-DNA inserční mutageneze, RNA interference (RNAi), využití reportérových genů, selekčních markerů a dalších molekulárně-biologických přístupů používaných při charakterizaci genové funkce. V oblasti aplikovaného výzkumu jsou diskutovány možnosti využití transgenních technologií ve šlechtění rostlin, vývoj geneticky modifikovaných (GM) plodin, strategie zvyšování odolnosti vůči biotickým a abiotickým stresovým faktorům, perspektivní transgenní technologie a jejich význam pro udržitelné zemědělství. Součástí výuky jsou také základní principy legislativní regulace geneticky modifikovaných organismů, hodnocení rizik a právní rámec využívání GMO v České republice a Evropské unii. Praktická část předmětu je zaměřena na osvojení základních metod rostlinné transformace. Studenti se prakticky seznámí se stabilní transformací modelové rostliny Arabidopsis thaliana metodou "floral dip" a s tranzientní transformací Nicotiana benthamiana prostřednictvím agroinfiltrace. V rámci laboratorních cvičení si osvojí přípravu a kultivaci bakteriálních kultur Agrobacterium, vlastní transformační postupy a následnou analýzu exprese fúzních proteinů pomocí fluorescenční mikroskopie. Součástí praktické výuky je rovněž izolace protoplastů z transformovaných listů N. benthamiana, selekce transformovaných semen a rostlin A. thaliana, vyhodnocení výsledků transformace a zpracování obrazového materiálu z mikroskopie. Během semináře studenti prezentují výsledky získané v průběhu laboratorních cvičení, interpretují experimentální data a aktivně se zapojují do odborné diskuse.
Po absolvování kurzu by měl být student schopen porozumět principům genetické transformace rostlin, samostatně zvládnout nejpoužívanější transientní a stabilní transformační metody využívané v rostlinné biotechnologické praxi a orientovat se v základních metodických, aplikačních a legislativních aspektech rostlinných biotechnologií.
|
|
Předpoklady
|
nespecifikováno
|
|
Hodnoticí metody a kritéria
|
Písemný test, Závěrečný projekt
Účast na praktických cvičeních (100%), splnění prezentací dle anotace a aktivní zapojení do diskuse na Journal clubech, zpracování protokolů z praktických částí cvičení a úspěšné absolvování zápočtové písemky.
|
|
Doporučená literatura
|
-
PDF prezentace z jednotlivých seminářů.
-
Clough SJ, Bent AF. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 16. 1998.
-
Davis AM, Hall A, Millar AJ, Darrah C, Davis SJ. Protocol: streamlined sub-protocols for floral-dip transformation and selection of transformants in Arabidopsis thaliana. Plant methods, 5, 3. 2009.
-
J.-F. Li, E. Park, A.G. von Arnim, A. Nebenführ . (2009). The FAST technique: a simplified Agrobacterium-based transformation method for transient gene expression analysis in seedlings of Arabidopsis and other plant species. Plant Methods 5.
-
Jim M. Dunwell, Andy C. Wetten. (2012). Transgenic plants-methods and protocols. New York.
-
Ondřej M., Drobník J. (2002). Transgenoze rostlin. Akademia.
-
Wang K. (2006). Agrobacterium protocols, 2-nd edition. Humana Press.
-
Wegel D. and Glazebrook J. (2002). The Arabidopsis Book. New York.
|