1. Základní terminologie, koncept imunodetekce, její využití na tkáňové a buněčné úrovni, principy a metody detekce epitopů, imunofluorescence, imunohistochemie, imunocytochemie. 2. Základní koncepce užití imunofluorescence na pletivové a na buněčné úrovni, principy detekce epitopů v buňkách in situ a v izolovaných frakcích. Porovnání s jinými metodami fluorescenční detekce. Principy a způsoby detekce proteinů a jiných molekul. 3. Základní metody detekce pomocí přímé a nepřímé imunofluorescence. Detekční systémy založené na principu specifických protilátek a biotin-streptavidin systému. Konjugace značek, selektivita a specificita. Detekce pomocí fluorochromů a porovnání s metodami využívajících konjugovaných enzymů, koloidních částic zlata a stříbra. 4. Praktické využití fluorescence k detekci protilátek, princip imunofluorescenčního značení. Primární a sekundární protilátky. Koncentrace protilátek, doba a podmínky inkubace, blokace nespecifické vazby, pozitivní a negativní kontroly. 5. Metody přípravy vzorků pro imunofluorescenci. Způsoby fixace fyzikálními, chemickými a kombinovanými metodami, zabezpečení dostupnosti epitopů pro protilátky. Imunofluorescenční mikroskopie celých biologických objektů a řezaných vzorků. 6. Videosekvence kompletních postupů imunofluorescenčních a imunohistochemických značení podle ověřených protokolů. 7. Imunologické základy využití protilátek v buněčné biologii, struktura, rozdělení, funkce a typy protilátek, selektivita, specificita, validace. 8. Sekundární protilátky, specificita, konjugáty. 9. Příklady praktického výběru primárních a sekundárních protilátek, experimenty s jednoduchým, dvojitým a trojitým imunoznačením, otázky křížové reaktivity protilátek a hostitelské specificity. 10. Protokoly pro imunofluorescenční mikroskopii: I. Buněčné monovrstvy, suspenze, "wholemounts". 11. Protokoly pro imunofluorescenční mikroskopii: II. Zalévání a řezání vzorků pro imunofluorescenční mikroskopii. 12. Fluorescenční vlastnosti konjugovaných fluoroforů, separace excitačních/emisních spekter, vícekanálové zobrazování imunofluorescenčních preparátů.
|
-
Bacallao R, Sohrab S, Phillips C. (2006). Guiding principles of specimen preservation for confocal fluorescence microscopy. In: Handbook of Biological Confocal Microscopy, Third Edition.
-
Hammers C., M., Stanley J., R.. (2014). Antibody Phage Display: Technique and Applications. Journal of Investigative Dermatology.
-
Harms, P.V. et al. (2023). Multiplex Immunohistochemistry and Immunofluorescence: A Practical Update for Pathologists. Mod Pathol. 2023;36:100197. doi: 10.1016/j.modpat.2023.100197.
-
Rüker, F., Wozniak-Knopp, G. (2020). Introduction to Antibody Engineering (Learning Materials in Biosciences).
-
Wymer CL, Beven AF, Boudonck K, Lloyd CW. (1999). Confocal microscopy of plant cells. Methods in Molecular Biology, vol. 122: Confocal Microscopy Methods and Protocols.
|