|
Vyučující
|
-
Ovečka Miroslav, prof. Mgr. Ph.D.
|
|
Obsah předmětu
|
1. Historie vývoje a zavedení imunofluorescence do biologického výzkumu, teoretické základy a hlavní přednosti imunofluorescence. Porovnání s jinými metodami fluorescenční detekce. 2. Základní koncepce užití imunofluorescence na pletivové a na buněčné úrovni, principy detekce epitopů v buňkách in situ a v izolovaných frakcích. Principy a způsoby detekce proteinů a jiných molekul. 3. Základní metody detekce pomocí přímé a nepřímé imunofluorescence. Detekční systémy založené na principu specifických protilátek a biotin-streptavidin systému. Konjugace značek, selektivita a specificita. Detekce pomocí fluorochromů a porovnání s metodami využívajících konjugovaných enzymů, koloidních částic zlata a stříbra. 4. Metody přípravy vzorků pro imunofluorescenci. Způsoby fixace fyzikálními, chemickými a kombinovanými metodami, zabezpečení dostupnosti epitopů pro protilátky. Imunofluorescenční mikroskopie celých rostlinných orgánů a řezaných vzorků. 5. Praktická příprava rostlinných preparátů na imunofluorescenční detekci, provedení fixace, digesce buněčné stěny a permeabilizace plazmatické membrány. 6. Imunologické základy využití protilátek v buněčné biologii, struktura, rozdělení, funkce a typy protilátek. 7. Způsoby využití protilátek v imunofluorescenční mikroskopii. Primární a sekundární protilátky. Koncentrace protilátek, doba a podmínky inkubace, blokace nespecifické vazby. Fluorescenční vlastnosti konjugovaných fluorochromů, separace excitačních/emisních spekter, vícebarevná kolokalizace, pozitivní a negativní kontroly. 8. Různé metody dobarvení buněčných struktur rostlinných vzorek po imunofluorescenčním značení k mikroskopické identifikaci. Metody přípravy trvalých preparátů uzavíráním vzorek do vhodného media, předcházení vypalování a uhasínání fluorescence při mikroskopickém snímání. 9. Praktické imunoznačení připravených fixovaných rostlinných objektů pomocí předem určené primární a sekundární protilátky, konečná příprava preparátů k mikroskopování. 10. Mikroskopování připravených preparátů na fluorescenčním mikroskopu a konfokálním laserovém skenovacím mikroskopu. Demonstrace specificity, stability a intenzity fluorescenčního značení. 11. Konfokální mikroskopie s rotujícím diskem, vyhodnocování změn ve struktuře a pohyblivosti cytoskeletálních a endozomálních buněčných struktur 12. Zhodnocení metodických přístupů a získaných dat formou prezentace interaktivních protokolů.
|
|
Studijní aktivity a metody výuky
|
|
nespecifikováno
|
|
Výstupy z učení
|
Poskytnout komplexní teoretické a praktické informace k pochopení významu metody a její praktické aplikaci při studiu rostlinných buněk
Studenti získají teoretické základy k pochopení přínosů imunofluorescence v buněčné biologii rostlin se schopností tyto vědomosti prakticky aplikovat
|
|
Předpoklady
|
nespecifikováno
|
|
Hodnoticí metody a kritéria
|
nespecifikováno
Účast a vypracování protokolu z praktické části
|
|
Doporučená literatura
|
-
Bacallao R, Sohrab S, Phillips C. (2006). Guiding principles of specimen preservation for confocal fluorescence microscopy. In: Handbook of Biological Confocal Microscopy, Third Edition. Springer Science+Business Media, LLC, New York.
-
Haseloff J, Dormand E-L, Brand AH. (1999). Live imaging of green fluorescent protein. Methods in Molecular Biology, vol. 122: Confocal Microscopy Methods and Protocols . Humana Press Inc., Totowa, NJ.
-
Wymer CL, Beven AF, Boudonck K, Lloyd CW. (1999). Confocal microscopy of plant cells. Methods in Molecular Biology, vol. 122: Confocal Microscopy Methods and Protocols. Humana Press Inc., Totowa, NJ.
|